大多數病變都深藏在人體內部，其深度在體表下幾厘米到十幾厘米不等。目前臨床主要采用醫學成像技術確定病變的位置，為確定治療策略、手術計劃和手術指導提供信息。例如，在光動力治療前對病變深度的估計可以幫助確定合適的藥物類型、劑量和激光參數。同時，在前哨淋巴結活檢時對淋巴結的準確深度估計有利于病灶的識別，縮短手術過程，減少手術中的出血風險。


(資料圖)

迄今為止，光學技術因其實時采集能力、非電離輻射等優勢而備受關注。當前，深部病變的無創光學三維成像是臨床應用的長期目標。特別地，采用純光學方法來確定活體環境中的病灶深度是一個關鍵挑戰。

表面增強拉曼光譜（SERS）在這一應用中具有許多優勢，其具有窄線寬的指紋光譜，可以明確區分目標光譜和組織背景，具有高通量檢測的潛力。透射拉曼光譜技術被開發用于深度SERS檢測。透射拉曼光譜是將激光照明區域和信號收集區域分離在樣品的對側，可抑制表層的背景噪聲，從而提高深層信號的信噪比。但是，在實現檢測的前提下，需要解決一個進一步的問題：如何確定病灶的位置？當前，基于透射拉曼光譜來估計渾濁介質中病灶深度的方法目前也有少量報道。然而這些方法強烈依賴于在同一均質組織中預測模型的預先校準，而對真正的復雜介質，如超厚的非勻質組織與真實活體組織，仍然具有極大挑戰性。

此前，上海交通大學生物醫學工程學院葉堅教授團隊已設計與搭建了一個具有深層檢測能力的拉曼檢測/成像系統，并成功在安全光照劑量內通過體外14 cm厚的豬肉組織實現了對包埋在其中的納米探針標記的病灶仿體的檢測（In Vivo Surface-Enhanced Transmission Raman Spectroscopy Under Maximum Permissible Exposure: Toward Photosafe Detection of Deep-Seated Tumors. Small Methods, 2023, 7(2), 2201334）。

為解決病灶深度定位的問題，近日，葉堅教授和林俐助理教授帶領博士研究生張玉敏在前期研究的基礎上進一步提出了一種快速和穩健的方法，利用比率透射拉曼光譜，對生物組織中的SERS病灶仿體的深度進行準確評估（如圖1）。相關成果“A rapid and universal method for depth estimation of lesions in heterogeneous tissues via photosafe ratiometric transmission Raman spectroscopy”發表在《VIEW》（2023）。該團隊首先從理論上研究了光子在生物組織中傳播的衰減，如圖2所示，發現：（1）拉曼峰-峰強度比值的自然對數和深度之間存在線性關系；（2）線性關系的斜率可以根據兩個波長下拉曼光子的有效衰減系數提前計算出來，截距可以由純SERS納米探針的拉曼峰-峰強度比值的自然對數取得；（3）組織厚度、激光束大小、積分時間和激光功率等對線性關系的影響可以忽略。以上的關系表明無需事先了解組織厚度、納米探針的濃度或拉曼測量參數，可以利用拉曼峰-峰強度比值的自然對數來預測組織中病變的深度。

圖2. 均質組織中SERS納米探針標記病灶的拉曼信號峰-峰比值對數與病灶深度的理論關系

基于上述發現，他們用前期開發的透射拉曼系統和安全的光照劑量，在實驗上證實了這種線性關系，并在超厚（3-5 cm）的離體豬脂肪和肌肉組織中實現了SERS納米探針標記病灶仿體的準確的深度計算，均方根誤差低至2.42%。此外，他們還證明了不同的拉曼峰對均具有深度預測的能力，這為選擇合適的拉曼峰對來避免背景組織的干擾提供了便利，多個拉曼峰的組合更為預測復雜組織中病變的深度提供了可能。

圖3. 異質組織中SERS納米探針標記病灶的深度預測模型

因此，該團隊進一步地研究了上述線性關系在非均質組織中的有效性。他們分析了在異質組織模型中兩個拉曼峰強度比自然對數值與病灶深度間的關系，發現該關系曲線在每個組織交界面處都會發生變化，但同一類型的均質組織在不同層的線性模型斜率是一致的，這主要是由兩個波長下拉曼光子的有效衰減系數之差決定的（如圖3）。根據此發現，考慮到拉曼光譜獨特的多峰與窄線寬特征，他們提出可以通過結合多個峰對的數據構建超定方程組，進行非勻質組織中病灶的快速深度預測。利用所構建的方程組深度預測模型，他們成功在5 cm的離體異質組織塊中實現了SERS病灶仿體的準確的深度預測，均方根誤差為8.35%（如圖4）。

圖4. 異質組織中SERS納米探針標記病灶深度的實驗預測

最后，該團隊從理論上證實了上述深度預測模型在高度非勻質組織中（如真實的體內情況）進行病灶深度預測的可行性。這項技術具有快速、穩健和通用的優勢，可以分析復雜生物樣本中病變的深度信息，證明了比率透射拉曼引導的病變定位在實際臨床應用中的巨大潛力。

論文的第一作者為上海交通大學生物醫學工程學院張玉敏博士，上海交通大學生物醫學工程學院林俐助理教授和葉堅教授為共同通訊作者。該研究得到了國家自然科學基金委、上海市科學技術委員會、上海交通大學、上海市婦科腫瘤重點實驗室的支持。本課題也由上海市教育發展基金會、上海市教委“晨光計劃”資助。

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